荧光探剂与激光扫描共焦显微术

　　激光扫描共焦显微术的基本原理是，在细胞内一个任意选定的深度上将激光束聚焦成线度接近单个分子的极小的斑点，并在细胞内一定深度的层面上进行扫描，通过光学系统，即可得到细胞一个层面的清晰图象。连续改变激光的聚焦深度，在一系列的层面上进行扫描，最后获得整个细胞的三维图象。利用目前已达上千种与细胞内不同分子（或离子）特异性结合的荧光探针，人们就可以直接观测活细胞中各种重要生物分子的位置、运动以及与其它分子的相互作用等。例如观测细胞骨架上的微管、微丝与中间纤维，观察信号转导通路上的各种重要的酶与信使分子，还可利用基因重组技术将自身已有的荧光蛋白引入细胞，用激光扫描共焦显微镜研究基因的表达、细胞内蛋白质的相互作用与细胞内的交通等。荧光探针和荧光蛋白与激光共焦显微术的结合，使人们能够看到细胞内一个既复杂又异彩纷呈的世界。

　　多光子荧光成像技术

　　目前，共焦显微成像术使用的是可见光波段的氩离子激光器，因此可能引起活细胞的损伤。利用多光子，如多光子激发，至少有以下三个优点：一是由于近红外光激发，故对活细胞的损伤大大减小；二是在组织中由于近红外光比可见光的透光率高，因此可观测样品中更深层的荧光成像；三是许多用在可见区甚至紫区的荧光探剂照样可以使用。这种技术主要是使用高强度红外激光，使双光子的激发效率与短波长的单光子相当。现在已有一些激光器满足这一要求。

　　光钳和单分子操作

　　光钳（Opticaltweezer）技术诞生于20世纪80年代，发展于90年代。其基本原理是：当一个微粒（如一个与生物大分子结合的硅珠）处于一个强度按高斯分布的激光光束中时，由于光场强度的空间变化，光束将对微粒产生一种梯度压力，驱使其移向光束中心，并使其稳定在那里。这样，激光束就似钳子将粒子牢牢地钳住，并令其随光束人为地移动。光钳施加在微粒上的压力取决于光的波长、光束的宽度及功率等。当激光器的功率为几毫瓦到几瓦时，施加于尺寸为微米大小的微粒上的力大约为几个到几百皮(10-10)牛顿。为了不使激光被生物组织强烈吸收，为了不使激光被生物组织强烈吸收，光钳一般使用近红外激光器光源。光钳技术的重要应用是，用以研究和观测与肌肉收缩、细胞分裂、蛋白质合成等密切相关的一类蛋白质分子马达。研究时，将一个微米大小的硅珠或聚苯乙烯珠与这些分子马达接在一起，在显微镜下用光钳钳住小珠，启动分子马达，就可以测量出分子马达运动时产生的力。德国学者已经用激光在卵细胞膜上打孔，用光钳将精子抓住并送入卵细胞，大大提高了体外受精的成功率。今后，新一代的光钳将具备施力的反馈机制，使光钳加在捕捉的离子上的力能改变其大小，从而研究影响分子马达的各种因素。光钳还可以用来对细胞进行各种加工等。因此，光钳将在细胞工程技术方面发挥重要的作用。