据悉，来自美国国家标准技术研究院（NIST）和弗吉尼亚联邦大学（VCU）的研究人员现已开发出一种基于激光纳米孔快速加热方法测量来监控分子进出纳米孔时能量的自由分布。该研究成果2021年4月21日Science Advances上。

纳米多孔系统中聚合物能量学的研究始于1970年代，当时研究的是大分子在其他纳米多孔材料中分配给沸石和凝胶的分配系数。这催生了对受限聚合物链的静态和动态特性的理论研究。这项工作的重点是应用定标律来理解孔内扩散系数和聚合物分配系数，这两者都可以使用使用大量多孔材料来测量分子的整体性质的技术进行研究。尽管这些集成方法提供了对聚合物-孔隙相互作用的重要见解，但单分子纳米孔传感技术的出现为更基础的研究聚合物-孔动力学提供了平台。

使用福克-普朗克方程(Fokker-Plank方程)和聚合物理论的详细分析，可以在聚合物孔隙动力学与聚合物逸出纳米孔的自由能垒之间建立联系。之前有大量报告研究了聚合物纳米孔的相互作用，提供了潜在井的详细粗粒度模型和化学特异的分析模型。限制在纳米孔中的聚合物自由能的最全面模型包括来自排除的体积效应的势能、分子间键的振动模式、外部电场和静电相互作用。进一步的扩展还包括聚合物与溶剂和电解质成分的相互作用，这提供了对中空聚合物在纳米孔中模拟电压依赖性效应的能力。

尽管大多数研究都讨论了熵是自由能垒的主要贡献者，但有证据表明，焓可以起关键作用，特别是在增强了孔内可用静电相互作用的改性系统中。分离热力学组分的一种成功方法是用弱相互作用的阳离子（如Li＋）代替弱相互作用的阳离子（如K＋）。但是，更直接的方法是测量聚合物-纳米孔动力学随温度变化的函数，以构建Arrhenius图，从中可以明确地提取焓和熵。尽管可以通过红外灯或密封的Peltier装置对纳米孔装置进行温度控制，但是这些实验的繁琐和缓慢的特性（即，温度在每分钟时间尺度上的变化）将详细的热学研究的数量限制为仅几个示例。

为了克服静态外部温度控制方法的挑战，来自弗吉尼亚联邦大学和国家标准与技术研究所 (NIST) 的研究人员使用了基于激光的加热方法，该方法可以动态控制局部温度。可以通过用红外光直接激发水中的振动模式或通过纳米等离子辅助加热以及半导体材料中电子模式的激发（间接）来实现光学加热。

该团队通过制造形成细胞膜的生物材料的人工版本来构建其生物传感器。它被称为脂质双层，它包含一个直径约2纳米（十亿分之一米）的细小孔，周围被流体包围。溶解在流体中的离子穿过纳米孔，产生小的电流。但是，当将感兴趣的分子驱动到膜中时，它会部分阻止电流流动。这种封锁的持续时间和大小可作为指纹，识别特定分子的大小和性质。为了对大量的单个分子进行准确的测量，目标分子必须在纳米孔中停留的时间既不能太长也不能太短（“ Goldilocks”时间），范围从百万分之一秒到十分之一秒。问题在于，如果纳米孔以某种方式将它们固定在适当的位置，则大多数分子仅在此时间间隔内停留在纳米孔的小体积中。这意味着纳米孔环境必须提供一定的屏障，例如增加静电力或改变纳米孔的形状，这会使分子更难以逃脱。对于每种类型的分子，突破障碍所需的最小能量各不相同，这对于生物传感器高效，准确地工作至关重要。计算该数量涉及测量与分子进入和移出孔时的分子能量有关的几个属性。至关重要的是，目标是测量分子与周围环境之间的相互作用主要是由化学键还是由分子在捕获和释放过程中摆动和自由移动的能力引起的。

02:26

▲图1. 实验装置图和相应的加热轨迹。

(A) 实验装置的示意图。(B) PEG28与纳米孔相互作用的典型电流迹线，作为Au-簇的分隔物，进入和流出αHL的前庭。(C) 和 (D) 分别显示了PEG28和AT1的温度校准电流，因为聚合物与开孔相互作用。电流（和温度）由红外激光通过一个振荡周期进行调制。(E) 在24°C下显示Au-簇（实心正方形）和开孔（空心正方形）构型的PEG-αHL停留时间分布。(F) AT1-αHL的停留时间分布显示为在24°C下具有Au簇（实心正方形）和开孔（空心正方形）构型。显示的数据是在70 mV施加跨膜电势下在3 M KCl中收集的。在所有实验中，接地电压均参考孔的反面。(E) 和 (F) 中的误差线是根据计算为计数平方根的1 SD估算的。

到目前为止，由于多种技术原因，缺少用于提取这些高能成分的可靠测量方法。在这项新研究中，由NIST的Joseph Robertson和VCU的Joseph Reiner共同领导的一个团队证明了使用基于激光的快速加热方法测量这些能量的能力。

图2说明了激光驱动温度控制（动态控制）的优点； 在基于激光的加热条件下观察到了AT1，并将其与使用静态珀尔帖控制温度控制的类似实验进行了比较。进行比较的目的是确保基于动态激光的温度调制不会产生任何意外的系统偏差。基于激光的加热与整体溶液加热之间的协议表明，激光加热器不会将杂散伪像（即通过对流或辐射传递）引入系统。研究人员注意到，由于数据收集（包括点之间的温度平衡）需要30分钟以上的时间才能生成包含三个离散数据点的数据集，因此通常无法进行重复的体温测量。

▲图2. 整体加热和基于激光的加热的Arrhenius图的比较。

通过基于激光的动态加热（空心符号，三个不同的孔）和基于珀尔帖的大量加热（实心黑圈，一个孔）产生的阿伦尼乌斯图显示了方法之间的一致性。实线是对每个数据集的最小二乘线性拟合。静态加热条件对应于通过嵌入分析室中的PID控制的Peltier设备进行的温度控制。动态加热条件对应于通过AOM调制的1444 nm激光器进行的温度控制。静态实验产生了三个离散温度。静态数据集的误差线是根据观察到的停留时间的标准偏差估算的。代表性数据来自AT1在70 mV和3 M KCl（pH 7.2）中的数据。

测量必须在不同的温度下进行，并且激光加热系统可确保这些温度变化快速且可重复地发生。这使研究人员可以在不到2分钟的时间内完成测量，而原本需要30分钟或更长时间。没有这种新型的基于激光的加热工具，他们的经验表明，根本无法进行测量。因为它们将既耗时又昂贵。实质上，研究人员已经开发了一种工具，可以改变纳米孔传感器的开发流程，以迅速减少涉及传感器发现的猜测。

进行能量测量后，它们可以帮助揭示分子如何与纳米孔相互作用。然后，科学家可以使用此信息来确定检测分子的最佳策略。

例如，考虑一个主要通过化学相互作用（基本上是静电相互作用）与纳米孔相互作用的分子。为了达到Goldilocks的捕获时间，研究人员进行了实验，对纳米孔进行了修饰，以使其对目标分子的静电吸引既不太强也不太弱。出于这一目标，研究人员用两个小肽，即构成蛋白质构建基团的化合物的短链，展示了该方法。其中一种肽，血管紧张素可稳定血压。另一种肽，神经降压素，有助于调节多巴胺，多巴胺是一种影响情绪的神经递质，在大肠癌中也可能起作用。这些分子主要通过静电力与纳米孔相互作用。研究人员将纳米颗粒中的金纳米颗粒插入了带电材料，从而增强了与分子之间的静电相互作用。

研究小组还研究了另一种分子，聚乙二醇，其移动能力决定了它在纳米孔中花费了多少时间。通常，该分子可以不受环境的束缚而自由摆动，旋转和伸展。为了增加分子在纳米孔中的停留时间，研究人员改变了纳米孔的形状，使分子更难以挤过微小的空腔并退出。

研究人员可以利用这些变化来构建适合检测特定分子的纳米孔生物传感器。最终，研究实验室可以使用这种生物传感器来识别感兴趣的生物分子，或者医生办公室可以使用该设备来识别疾病的标记。

本文来源：Christopher E. Angevine et al, Laser-based temperature control to study the roles of entropy and enthalpy in polymer-nanopore interactions, Science Advances (2021). DOI: 10.1126/sciadv.abf5462