LED技术正让我们的生活变得越来越精彩。过去的50年里，LED技术的应用已经从电子产品中简单的指示灯扩展到了取代家用照明白炽灯,为地球节约了数以太(1012)瓦计的电力。基于其高亮度、高可控性及宽光谱输出的特点，LED近期发展出了一些不为大家所熟知的专业照明应用。
荧光显微技术在生命科学中运用广泛，常常被用来研究生物样本，包括单细胞到整个组织的样本。这个过程涉及到利用光学显微镜使用特定波长的光束来刺激样品。由于斯托克斯（Stokes）位移——物质被光激发后，产生的电子跃迁（荧光）中，其吸收谱和发射谱峰值间的波长差或频率差，光束重新发射的荧光波长大于原激发光的波长。而把荧光显微技术中传统使用的灯泡换成LED光源，这一改变为该领域带来的效益远不止大大降低运行成本。
图 荧光显微镜的基本构造。图片来源：Luther Hindley/CoolLED公司
作用一：满足光谱需求
有些研究需要使用活细胞成像，另一些需要使用被化学试剂固定于某一特定生命时期的细胞。不论何种情况，用于照明样本的光源类型和设计对显微镜所需的硬件以及所记录图像的质量和有效性都有极大的影响。
早期使用LED系统的一个重要原因在于使用者及实验管理的便利性。最常见的灯泡，例如100 W高压汞灯，其寿命很短，约为300小时。使用者通常会在记事本上记录打开灯泡的时间，因为如果使用灯泡的时间过长，会增加爆炸的风险。然而，LED产品的使用寿命长达数万小时。
灯泡需要预热与冷却，而且一整天都要这样。而LED光源可以在需要的时候以电子方式打开或关闭，即在观察样本或成像期间打开光源，不使用的时候关闭。尽管用LED光源替代灯泡的卖点很多，但同时存在高亮度及光谱范围这两个主要问题，LED光源最初并未被广泛应用。
LED光源发出的光不是宽光谱而是半峰宽约10 nm至40 nm的类高斯光谱。因此光源设计人员要使用多个LED来满足研究人员的光谱需求，这就带来了光源设计过程中新的光电和机械复杂性，而这些问题对于传统光源来说是不存在的。捕捉和校准LED芯片的朗伯发射，然后使用双色镜组合出多种颜色，这已经成为了标准方法。朗伯定律表明，从漫反射表面观察到的发光强度与入射光和表面法线之间夹角θ的余弦值成正比。这种复杂性和损耗导致大多数LED光源最多能包含6种不同波长的光。
一种新颖且已获得专利的方法采用了波长组概念，即具有相近光谱的LED光波长成为一个用户可选择的通道，根据对高速应用的需求，可以把四组光谱分离的LED组合在一起。但关键是，某些波长接近的分组，在相同的样本中很少会同时用到。如今，研究人员可以使用包含16种波长的LED光源，使用这种方法能够提高LED的亮度、谱段范围，也能降低成本。
长期以来，灯泡光谱的绿光区域是最弱的，这部分区域在固态照明中被称为“绿色缺口”，也是LED光谱中极其微弱的区域。一种解决方法是使用由一系列明亮蓝色LED激发的荧光棒。与单芯片LED相比，在常见的荧光显微镜上使用这种方法会增加成本且使用不方便。对蓝色LED芯片功率的最新研究提出了更为简单的解决方案，即在LED上直接放置荧光剂，且只选择能够提供最大绿色光谱区域的荧光剂。下图中展现了由明亮绿色LED通过斯托克斯位移激发的红色光。
图 使用荧光标记的牛肺动脉内皮细胞。蓝色区域为细胞核，绿色区域为微管蛋白，红色区域为肌动蛋白。图片来源：Jordi Recasens/Izasa Scientific。
作用二：成像增强
显微技术的最终目标是获取优质图像。LED由于其固态特性可作为显微镜附件直接使用，无需重新校准。采用科勒照明（一种现代科学光学显微镜下的样品照明技术），光源中的光学器件可将LED成像到显微镜物镜的后孔径上。这种反向工作的物镜能够在样品的完整视场内均匀地分散光线，然而一些LED系统仍使用导光板，以减轻显微镜的重量和振动。
具有良好的阻挡和传输区域的滤光片能够改善图像的信噪比。在用于DAPI（6-二脒基-2-苯基吲哚）荧光团成像的典型激发滤光片和发射滤光片中，激发滤光片要挡住汞（Hg）光谱中蓝色区域的高能量光线。
图 激发和发射滤光片系统中，385 nm LED光和Hg光谱与DAPI的吸收和发射光谱重叠情况。图片来源：Gerard Whoriskey/CoolLED 公司。
相比之下，用于激发DAPI的LED在相应的激发带上产生了极低的能量，包括在样品成像相对较弱的蓝色区域。对比结果为，使用LED作为光源能够获得更好的图像信噪比，因为它减少了样品的背景色阶。爱丁堡大学的Sandrine Prost及其同事们的研究表明采用波长可控的独立LED光源，其信噪比的提高超过了灯泡系统，甚至超过了一些白色宽频谱LED光源。
同时，样品观测结果也会受观察过程的影响，因为细胞不适合暴露在高强度光线下。不当光照的负面作用包括光漂白和光毒性，随着时间推移，光照将导致信号减弱、活细胞死亡或行为异常。减少样品的照明时间对降低这些负面效应至关重要。传统灯泡光源通过机械快门来控制曝光，有时会造成长时间的延迟，导致样品在相机的曝光时间内被不必要地照亮。
使用自动控制的LED光源则可以解决这个问题。LED的直接逻辑电路（TTL)控制达到了微秒量级的开/关时间，优于USB通信方式。许多高端相机在曝光时有TTL信号输出，该信号可以直接反馈至LED光源，控制光源开/关，与相机曝光时间精确匹配。由于连续成像两至三个荧光团很常见，所以最新的LED光源将波长序列编程到光源内，相机按顺序依次进行曝光。这种电路连接方式减少了样品不必要的曝光，而机械控制的快门或者电脑控制方法都没有实时操作系统。
最近，高效节能的340 nm LED光源已经进入市场，可以进行钙荧光指示剂（Fura-2）的成像。这项应用可以捕捉到神经网络的活动以便对阿尔茨海默病和其它类似病症进行研究。英国Strathclyde大学的Peter Tinning及其同事们的研究表明，使用340nm或380nm的强LED系统，可使细胞中Fura-2浓度比标准细胞制备方案低25%。该研究不仅为实验研究节省了资金，更重要的是，能够降低荧光标记可能导致的细胞毒性效应，以观测到生物样品更为典型的自然行为。
原文链接：
https://www.photonics.com/Article.aspx?AID=62272&PID=2&VID=143&IID=954
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